北伐战争的直接打击目标，是受帝国主义支持的北洋军阀，主要有吴佩孚、孙传芳、张作霖三派势力，其兵力达70万人。这时，国民革命军除广东原有的6个军外，增加了新归附的第七、第八军，共有10万人左右。针对敌我兵力悬殊的形势，国民革命军在以加伦为首的苏联军事顾问的建议下，制定了集中兵力、各个歼敌的战略方针。
根据这个战略方针，1926年5月，国民革命军先头部队出兵湖南。7月9日，正式出师北伐。在沿途人民群众的大力支持下，北伐军势如破竹。到9月6日、7日，两湖战场的北伐军分别占领汉阳和汉口。10月10日攻克已被围困月余的武昌，全歼吴佩孚部主力。江西战场的北伐军也于11月初歼灭孙传芳部主力，占领九江、南昌。福建方面，12月中旬不战而下福州。北方冯玉祥部于9月17日在绥远五原誓师，挥军南下。11月间，国民军联军已控制陕西、甘肃等省。到1926年底，国民革命军已控制了除江苏、浙江、安徽以外的南部各省。冯玉祥的国民军联军也已控制西北地区，准备东出潼关，响应北伐军。北伐战争胜利的大局已定。
北伐战争能够在短时间内取得如此巨大的胜利，是国共合作结出的丰硕成果。在北伐过程中，国共两党之间虽存在矛盾，但基本上是团结的，仍能集中力量共同对敌。共产党员、共青团员在作战中舍生忘死，发挥了先锋模范作用。共产党员叶挺领导的独立团，成为赢得“铁军”称号的第四军中英勇善战的一支部队。共产党人进行的卓有成效的政治工作，使北伐军的许多指战员有着明确的革命目标和不怕牺牲、英勇作战的革命精神。共产党人还在发动工农群众方面作出巨大贡献，使北伐军所到之处，都能得到广大工人、农民和其他革命群众的直接支援。此外，苏联军事顾问的帮助和苏联提供的物资援助，对北伐战争的胜利进军也起了重要的作用。
随着北伐战争的胜利进军，工农运动以空前的规模迅速高涨起来。在湖南、湖北、江西等省广大农村，到处燃起革命的烈火。农民建立自己的政权和武装，其势如暴风骤雨，迅猛异常，把统治几千年的封建特权和土豪劣绅打得落花流水，真正做到了“一切权力归农会”，造成一个空前的农村大革命的局面。在城市，工人在工会组织的领导下，仿效省港大罢工的经验，组织武装的纠察队。一些城市相继举行罢工，大都取得胜利。1926年10月和1927年2月，上海工人两次发动的武装起义虽然失败了，但在革命群众中产生很大影响。群众性的反帝斗争蓬勃展开，推动国民政府收回了汉口、九江的英租界。
北伐战争的胜利进军和工农运动的高涨，未能遏制革命阵营内部的危机。蒋介石进一步加紧对军队和政权的控制，实力迅速膨胀。帝国主义列强认定蒋介石等所代表的势力同样是反共的力量，开始对他们进行拉拢。不少原来属于北洋军阀或地方军阀的军队纷纷接受蒋介石的改编，一批批政客、官僚也投靠到蒋介石身边。
在这种背景下，蒋介石的反共面目公开暴露出来。他提出要把国民党中央和国民政府迁到北伐军总司令部所在地南昌，以便置于他的直接控制之下。在他的指使下，赣州、九江、安庆等地都发生杀害共产党人和捣毁总工会、国民党左派控制的党部等严重事件。南方革命阵营分裂的明朗化，表明蒋介石右派集团的公开叛变只是时间问题了。
这时，共产党人本来应该而且有可能直接掌握更多的军队和一部分地方政权，以便应付可能发生的突然事变。可是，中共中央忽视对军队的争取，片面地着重于民众运动。结果，当蒋介石发动突然袭击时，中共中央不仅在精神上缺乏准备，而且在实际力量对比上难以组织起有力的反抗。大革命走向失败的趋势，已很明显了。
面对革命阵营随时可能发生分裂的严重局面，中共中央于1926年12月13日召开特别会议。陈独秀提出既要防止“军事政权”的“向右”，又要防止民众运动的“向左”。在迫在眉睫的危局中，这次会议没有能够解决党如何生存并坚持斗争的问题，反而决定对群众运动采取消极压制的方针，造成的后果极其严重。会后，右倾机会主义的错误方针开始在实际工作中得到贯彻。
对于这种右倾错误，党内一部分同志进行了抵制和反对。毛泽东在1927年初对湖南农民运动进行32天考察。他在所写的考察报告中，尖锐地批驳党内外对农民运动的种种责难，论述了农村革命的伟大意义。瞿秋白等也对右倾错误进行了比较系统的批判。
1927年3月21日，当北伐军推进到上海近郊时，英勇的上海工人在陈独秀、罗亦农、周恩来、赵世炎、汪寿华等组成的特别委员会领导下，发动总罢工，随即转为武装起义，由周恩来担任总指挥。经过三十多个小时的战斗，占领上海除租界以外的地区，并成立上海特别市临时市政府。这次起义的胜利，充分显示了中国工人阶级的力量。
上海工人第三次武装起义胜利后，屯兵上海南郊的北伐军开进市区。3月24日，北伐军占领南京。当天下午，游弋在长江江面的英、美军舰借口保护侨民，猛烈炮轰南京，造成中国军民严重伤亡。南京事件后，蒋介石加快了勾结帝国主义实行反共的步伐。4月初，蒋介石等在上海举行秘密会议，决定用暴力手段实行“清党”。
中共中央和中共上海区委对蒋介石的阴谋活动有所觉察，力图巩固革命成果。但共产国际仍对蒋介石抱有期望，不赞成同蒋破裂。这样，由陈独秀出面，同刚从海外归国的汪精卫于4月5日发表联合宣言，把“国民党领袖将驱逐共产党，将压迫工会与工人纠察队”说成是“谣言”，要求“不听信任何谣言”。汪陈宣言的发表，使一部分共产党员放松警惕，误以为局势已经缓和下来。
4月12日，蒋介石突然在上海向革命群众举起屠刀，发动反革命政变。随后，在江苏、浙江、安徽、福建、广东、广西等省也相继以“清党”为名，大规模捕杀共产党员和革命群众。仅广东一地，被捕杀者就达2000多人。北方的奉系军阀张作霖也捕杀大批共产党员和革命群众。4月28日，李大钊在北京英勇就义。
四一二反革命政变发生后，国内政局迅速逆转。除以张作霖为首的北京政府外，蒋介石于4月18日在南京另行成立“国民政府”，以与武汉的国民政府相对立。这就在全国形成了北京、南京和武汉三个政权对峙的局面。、
这时的武汉政府基本上还是革命的政府，直接管辖湖北、湖南、江西三省。中共中央迁到武汉后，继续同在武汉的国民党人合作。
在革命的紧要关头，中国共产党第五次全国代表大会于1927年4月27日至5月9日在武汉举行。出席大会的代表80多人，代表党员57967人。大会未能对武汉政府的各派作出正确的分析，导致了对汪精卫一派的右倾迁就政策，未能在党面临生死存亡的危急关头，为全党指明方向。
党的五大第一次选举了中央委员会和中央监察委员会。中央委员会选举了中央政治局，并选举陈独秀、张国焘、蔡和森组成中央政治局常务委员会，陈独秀为总书记。五大产生的中央领导机构，未能解决全党坚强有力的领导问题，自然无法遏制愈来愈恶化的局势。
党的五大闭幕后，武汉政府所辖地区的危机越来越严重，反共事件不断发生。在这种情况下，鲍罗廷和陈独秀等仍企图以让步来拉住汪精卫集团。党内对陈独秀右倾错误的不满越来越强烈。7月中旬，根据共产国际执行委员会的指示，中共中央实行改组，由张国焘、李维汉、周恩来、李立三、张太雷五人组成中央临时政治局常务委员会。7月13日，中共中央发表宣言，强烈谴责武汉国民党中央和国民政府已在公开地准备政变，决定撤回参加国民政府的共产党员，同时声明共产党将继续支持反帝反封建的革命斗争，愿意同国民党内的革命分子继续合作。这个宣言虽然发得迟了一点，但对振奋党内的革命精神起了积极的作用。
7月15日，汪精卫召开国民党中央常务委员会扩大会议，正式同共产党决裂。第一次国共合作终于全面破裂，持续三年多的轰轰烈烈的大革命最后失败了。
这次大革命失败的原因，从客观上说，一是帝国主义和封建势力的联合力量比革命阵营的力量要强大得多，并且有更多的政治经验；二是国民党背信弃义地对共产党及其领导的工农群众发动突然袭击。在主观上，是陈独秀等人在后期犯了右倾机会主义的错误。
在大革命的初期和中期，党的路线基本上是正确的，因而获得很大的胜利。但是，这时的党终究还处在幼年时期，是在统一战线、武装斗争和党的建设方面都缺乏经验的党，是对于中国的历史状况和社会状况、中国革命的特点和规律都懂得不多的党，是对于马克思列宁主义的理论和中国革命的实践还没有较深刻了解的党。因此，党的中央领导机关在一些重大问题上动摇不定；在大革命的后期，受了反革命势力的欺骗，没有能够领导全党采取果断有力的措施，革命遭到失败就难以避免了。
中国共产党作为共产国际的一个支部，直接受共产国际的指导。共产国际及其代表虽然对大革命起了积极的作用，但由于他们并不真正了解中国的情况，也作出过许多错误的指示，出了一些错误的主意。幼年的中国共产党，还难以摆脱共产国际的错误指导。这对酿成陈独秀右倾机会主义错误有直接影响。
曾经造成很大声势并取得重大成果的大革命虽然失败了，但它仍然具有深远的意义。通过这场大革命，中国共产党提出的反帝反封建的主张成为广大人民的共同呼声，党在群众中的政治影响迅速扩大，党的组织得到很大发展，千百万工农群众开始在党的领导下组织起来，党还开始掌握一部分军队。尤其是通过革命胜利和失败的反复，党经受了深刻的锻炼和严峻的考验。所有这一切，为党领导人民把革命斗争推向新的阶段准备了条件。
